Анализ иммуноферментный


Image 570

Среди методов анализа крови (ссылка на 3-ю статью в этом файле), позволяющих оценить способность организма противостоять инфекционным болезням и  показывающих фазу болезни, важное место занимает иммуноферментный анализ (ИФА). Проведение этого исследования позволяет всесторонне оценить деятельность защитной функции крови и выявить состояние иммунодефицита при инфекционных патологиях, также заболеваниях крови, аутоиммунных процессах, гормональных проблемах.

Каким же образом удается охватить столько целей в одном анализе, и какие имеются показания для его проведения? Попробуем разобраться.


Оглавление:   Что такое анализ крови, проводимый методом ИФА  Какие бывают иммуноглобулины  Показания к назначению иммуноферментного анализа крови  Как проводится ИФА крови  Преимущества метода иммуноферментного анализа крови  Есть ли недостатки у ИФА крови?  Иммуноферментный анализ крови в паразитологии  

Что такое анализ крови, проводимый методом ИФА


immunoglobulins-h4eЭто лабораторное исследование, которое позволяет определять наличие специфических антител (защитных факторов крови белковой природы) к определенным антигенам (болезнетворным агентам). Среди антител первостепенное значение имеют иммуноглобулины, которые могут существовать в виде иммунокомплексов.

Иммуноглобулины вырабатываются вследствие сложных нейрогуморальных  реакций  иммунитета человека, возникающих как ответная реакция на внедрение чужеродных антигенов. На каждый вид болезнетворного агента вырабатываются свои специфические антитела. Действуют они путем «связывания» антигена или патологического микроорганизма, образую комплексное соединение «антиген-антитело» с последующей нейтрализацией, ферментативным лизисом, реакциями фагоцитоза и выводом из организма.

Обратите внимание: именно по наличию определенных комплексов методом ИФА определяется вид возбудителя или имеющегося у больного вредного вещества.

Узнать базовые принципы функционирования иммунитет человека вы сможете, посмотрев данный видео обзор:


Какие бывают иммуноглобулины

Открыто и изучено 5 основных классов иммуноглобулинов – IgА, IgM, IgG, IgD, IgE.  роль остальных еще до конца не выяснена и она находятся в стадии научного исследования.

Обратите внимание: наиболее важное в практической медицине значение имеют иммуноглобулины классов – А, М и G. Информативность определения основана на разных временных промежутках их появления, максимума и исчезновения.

Рассмотрим этот вопрос более детально.

image020

Основная задача иммуноглобулина А (IgA) заключается в защитных функциях слизистых оболочек дыхательных путей, желудочно-кишечного тракта и мочевыделительной системы. При остром начале заболевания выявить их невозможно. Появляются эти защитные комплексы лишь со 2 недели начала заболевания, иногда позже. Основная масса иммуноглобулина А сосредоточена в слизистых тканях. Ориентировочно около 80%. Остальные антитела циркулируют в крови. Основная функция – обезвреживание и уничтожение микроорганизмов. После стихания острых проявлений заболевания количество этих иммуноглобулинов начинает уменьшаться и полностью уходит на сроке до 8 недель после начала болезни. Если IgA обнаруживаются в более поздние сроки, то это свидетельствует о хронизации процесса.


Главными и первыми маркерами острой фазы развивающейся патологии являются иммуноглобулины класса М (IgM). Обнаруживаются они к 5 суткам начала недомогания. Определить их наличие в крови можно около 6 недель. Затем они начинают быстро исчезать.

Остаточный иммунный ответ характеризует наличие в крови иммуноглобулинов класса G (IgG). Появление этих факторов в крови обнаруживается примерно через месяц после начала болезни. В дальнейшем они могут определяться в течение многих месяцев, лет и даже всю жизнь, выполняя защитную функцию от возврата (рецидива) болезни, а в некоторых случаях делая невозможным  вторичное развитие патологии. Если же количество иммуноглобулина G начало вновь расти, то можно подозревать повторное заражение. Подобный вывод можно сделать путем проведения двух-трех проб, сделанных с промежутком в 2 недели.

Иммуноглобулин Е (IgE) используется в практике паразитологии.

Иммуноглобулин D (IgD) располагается на B-лимфоцитах, находится в небольшой концентрации у здоровых людей. После 10 года жизни достигает максимальных значений. Количество иммуноглобулина D увеличивается при беременности, у больных системными заболеваниями соединительной ткани, бронхиальной астмой, заболеваниями, вызванные иммунодефицитным состоянием.

Показания к назначению иммуноферментного анализа крови

Определение антител к наличию в организме болезнетворных микробов, вызывающих:

  • сифилис;
  • трихомоноз;
  • уреаплазмоз и микоплазмоз.

Имеется рост количества иммуноглобулинов и при глистных инвазиях.

Диагностика проводится для обнаружения:

  • герпетических заболеваний;
  • группы вирусных гепатитов;
  • вируса Эпштейна-Барра;
  • цитомегоаловируса.

При помощи ИФА можно определять наличие антител к 600 видов аллергенов, обнаруживать состояние иммунодефицита, проводить комплексное обследование перед трансплантологическими операциями, проводить комплексный анализ на предмет эффективности лечения.

ИФА является дополнительным методом обнаружения онкологических клеток.

Как проводится ИФА крови

Image 571Для иммуноферментного анализа в большинстве случаев используется кровь пациентов, иногда производят забор ткани стекловидного тела, жидкости спинномозгового канала, околоплодных вод.

Кровь набирают через инъекционную иглу в шприц из локтевой вены. Исследование проводят натощак. Следует помнить, что прием некоторых медицинских препаратов может влиять на результат анализа. Перед сдачей крови необходимо воздержаться от курения, приема алкоголя. Исказить результаты может прием наркотических веществ.

В случае отрицательных значений иммуноглобулинов IgM, IgG, IgA можно говорить об отсутствии заболевания или его начальной фазе, также результат с минусами возможен при полном выздоровлении по прошествии значительного количества времени.

Если IgA и IgM не обнаружены, а IgG проявляется положительно, то по всей вероятности речь идет о сформированном иммунитете после инфекционного заболевания, или после прививки.


ИФА1В случае высокого титра IgM при отрицательных значениях IgG, IgA можно делать вывод о наличии остро протекающего инфекционного заболевания.

Одновременные положительные значения результатов иммуноглобулинов – IgA, IgM, IgG характерны для острой фазы рецидива имеющегося хронического заболевания.

Для хронической инфекции, находящейся в фазе стихания процесса (ремиссии) ИФА показывает отрицательные значения иммуноглобулина M (IgM), при этом результат иммуноглобулинов G (IgG) и A (IgA) будет положительным.

Преимущества метода иммуноферментного анализа крови

Главными достоинствами метода ИФА являются:

  • невысокая себестоимость анализа;
  • диагностическая специфичность, точность;
  • динамический контроль (повтор анализа для определения эффективности лечения и стадий заболевания);
  • возможность проведения массовых обследований в очагах инфекции;
  • скорость получения результата;
  • относительная простота анализа;
  • возможность использования информационных технологий в обработке;
  • безопасность и безболезненность для пациента.

Есть ли недостатки у ИФА крови?

Главным отрицательным моментом исследования является возможность получения ложноотрицательных и ложноположительных данных. Причиной недоразумений могут стать технические недочеты, прием медикаментов, который может исказить картину.

Обратите внимание: фальсифицировать результат анализа может нарушение обменных процессов в организме. Осторожность в выводах надо соблюдать при сочетании нескольких хронических процессов у больного.

Иммуноферментный анализ крови в паразитологии

fighaematobium-144AF75661E07D1898BВозможность применения ИФА в диагностике паразитарных заболеваний определяется специфическим иммуноглобулином E (IgE), который имеет тенденцию к повышению именно при этой группе заболеваний. Кроме того, иммуноглобулин Е является маркером атопических реакций связанных с аллергическими процессами. В крови он находится в незначительных количествах. Основная его локализация – слизистые оболочки, базофилы, маркофаги. Главная функция этого белкового комплекса заключается в защите слизистых  оболочек организма. Но в тоже время он является участником иммунных реакций, направленных против паразитов. Активацией IgE «заведуют» эозинофилы и макрофаги. Это важный факт в сопоставлении данных анализа при установлении диагноза болезни.

ИФА применяется для обнаружения:


  • круглых гельминтов (аскарид, остриц);
  • острой и хронической формы описторхоза;
  • трихинеллеза;
  • наличия лямблий (как дополнительный анализ);
  • форм лейшманиоза;
  • амебиаза;
  • содержания токсоплазм;

Важно: иммуноглобулины вырабатываются в организме в качестве антител к определенным антигенам. Поэтому даже при самой высокой специфичности анализа не исключаются погрешности в точности. При паразитарных заболеваниях процент вероятности составляет около 90%.

В заключение необходимо отметить, что современная иммунология постоянно находится в стадии развития, поиска новых методов диагностики и лечения заболеваний. 

Степаненко Владимир, хирург

29,999 просмотров всего, 1 просмотров сегодня

    okeydoc.ru

    Общие представления


    Что же это за исследование – анализ крови на ИФА? Аббревиатура расшифровывается как иммуноферментный анализ крови, в ходе которого определяется количественное и качественное содержание различных биологически активных веществ, а также антител и антигенов в биологическом материале.

    Общие представления
    Механизм проведения ИФА

    Что используется при иммуноферментном анализе крови:

    • кровь из вены;
    • спинномозговая жидкость;
    • слизь уретры, цервикального канала;
    • околоплодная жидкость;
    • содержимое стекловидного тела.

    Иммуноферментный анализ назначают с целью диагностирования заболеваний, которые передаются половым путем, инфекционных и онкологических процессов, аллергических реакций, расстройств в работе эндокринной и репродуктивной системах, аутоиммунных и иммунодефицитных заболеваний, а также для оценивания риска развития некоторых болезней сердечно – сосудистой системы, почек.

    Обследование крови на ИФА при беременности назначают с целью раннего выявления уродства плода, нарушений развития на начальных стадиях и контроля их динамики. Кроме того, анализ ИФА позволяет контролировать уровень содержания антител, способных спровоцировать развитие у ребенка тяжелых неврологических расстройств, тем самым предотвращая развитие осложнений не только во время беременности, но и в процессе родов.


    Современная диагностика крови дает возможность заблаговременно отреагировать на выявленные проблемы и в значительной мере укрепить здоровье, как самой мамы, так и ее малыша.

    Преимущества проведения анализа

    Преимущества ИФА крови относятся:

    • высокая (до 90%) степень чувствительности;
    • возможность раннего установления диагноза, с одновременным определением стадии заболевания;
    • невысокая стоимость реагентов, а, следовательно, доступность;
    • минимальное количество материала для исследования;
    • минимальные сроки получения результата анализа крови;
    • возможность длительного хранения реагентов;
    • способность контролировать динамику развития патологического процесса.
    Преимущества проведения анализа
    Тест-системы

    Минусы иммуноферментного анализа:

    • нельзя конкретизировать возбудителя заболевания, в лаборатории получают только иммунный ответ на него
    • возможность получения ложного результата (в очень редких случаях, преимущественно в период вынашивания беременности).

    Подготовка

    Принцип данного вида исследования крови базируется на образовании в организме человека специфических антител при попадании в него антигенов, то есть чужеродных агентов, вызывающих развитие того или иного заболевания. В результате их взаимодействия образуются комплексы «антиген — антитело», которые и подвергаются исследованию при осуществлении иммуноферментного анализа.

    В связи с этим, чтобы не повлиять на данные комплексы и, соответственно, на достоверность полученных результатов, анализ крови и другого биологического материала на ИФА требует определенной подготовки.

    Кровь сдают натощак, также за 14 дней до предполагаемого обследования специфическое лечение приостанавливается и употребление антибактериальных, противовирусных лекарственных препаратов прекращается.

    Кровь на ИФА сдается из вены. Непосредственно перед забором крови следует ограничить физические нагрузки, а также исключить курение и употребление алкогольных напитков.

    Методика проведения ИФА

    Существует несколько методик и способы проведения иммуноферментного анализа: прямой и непрямой способ, конкурентный и метод блокирования.

    В основе проведения обследования крови (любого другого биологического материала) на ИФА лежит алгоритм, заключающийся в осуществлении двух реакций – иммунной и ферментативной.

    В ходе первой патологические агенты связываются с защитными элементами клеток биологического материала, взятого для исследования. Образуется иммунный комплекс «антиген — антитело». Выглядит это следующим образом. Антигены присутствуют на поверхности абсолютно всех клеток.

    При попадании в организм чужеродных клеток происходит их захват иммунными клетками (на чьих поверхностях располагаются антитела), которые сопоставляют данные об антигенах с поверхности вновь поступивших клеток с информацией, заложенной в собственной «памяти». В случае несовпадения этих данных включаются защитные функции организма, заключающиеся в образовании иммунного комплекса.

    После этого осуществляют ферментативную реакцию, которая визуализирует результаты предшествующей реакции. Ее принцип основывается на превращении вещества из одного в другое. Для каждого вида ИФА образующего в процессе иммунной реакции материала существует определенный фермент, обработку которым используют для определения концентрации чужеродного агента (по интенсивности окрашивания раствора).

    Методика проведения ИФА
    Методика проведения ИФА

    Расшифровка

    Благодаря анализу крови на ИФА, лаборанты определяют содержание в анализе крови иммуноглобулинов A, G и M. Положительный результат при исследовании крови (другого биологического сырья) на ИФА дает возможность не только поставить диагноз, но и стадию заболевания, а также характер его протекания (острое или хроническое).

    Данные иммуноглобулины при наличии в организме пациента патологического процесса образуются в различные периоды заболевания:

    • Иммуноглобулины М, IgM – образуются через пять дней после начала заболевания и сохраняются в крови в течение 1,5 месяца, после чего исчезают. Выявление IgM указывает на наличие в организме острого первичного патологического процесса и необходимости усиленного терапевтического вмешательства.
    • Иммуноглобулины G, IgG – возникают спустя четыре недели с момента инфицирования, их наличие в организме можно выявить на протяжении нескольких месяцев. Выявление IgG указывает на наличие в анамнезе человека перенесенного заболевания. Повышение уровня их содержания может свидетельствовать также о повторном заражении.
    • Иммуноглобулины А, IgA – появляются в момент заражения и присутствуют в организме в течение четырех недель. Снижение их содержания говорит о начале выздоровления. Появление в анализах вновь после того, как человек прошел курс лечения и выздоровел, свидетельствует о переходе заболевания в хроническую форму. Одновременное выявление в результатах ИФА IgA и IgG также говорит о наличии в организме хронического процесса.

    Следует также отметить, что одновременное присутствие в анализах IgG и IgМ указывает на то, что хронический процесс обострился, и пациенту требуется начать лечение. Если же ни один из иммуноглобулинов в ходе обследования не был выявлен, это означает отсутствие иммунного ответа.

    sostavkrovi.ru

    Основные понятия и принцип метода иммуноферментного анализа

    Иммуноферментный анализ (ИФА) — это метод лабораторной диагностики, основанный на реакции «антиген-антитело», который позволяет выявить вещества белковой природы (в том числе ферменты, вирусы, фрагменты бактерий и другие компоненты биологических жидкостей).

    Чтобы понять, как устроен иммуноферментный анализ, попробуем разобраться в сути реакции «антиген-антитело». Антиген — это чужеродная для организма молекула, как правило, белкового происхождения, которая может попасть в тело человека вместе с инфекционным агентом. Частицы чужой крови (если она не совпадает с нашей по группе) также являются антигенами. В организме антигены способны вызывать иммунную реакцию, направленную на защиту целостности внутренней среды от чужеродных веществ. Поэтому наше тело синтезирует особые вещества — антитела (иммуноглобулины), способные по принципу «ключ к замку» соединяться с антигенами, связывая их в иммунный комплекс (этот процесс как раз называется реакцией «антиген-антитело»). Такие иммунные комплексы легче распознаются и уничтожаются клетками иммунитета.

    Существует несколько разновидностей антител, каждая из которых вступает в действие на определенном этапе иммунного ответа. Так, первыми в ответ на проникновение антигена в организм синтезируются иммуноглобулины класса М (IgM). Содержание этих антител наиболее высоко в первые дни инфекционного процесса.

    Следом за ними иммунная система выбрасывает в кровь иммуноглобулины класса G (IgG), которые помогают уничтожать антигены до полной победы над инфекцией, а также продолжают циркулировать по сосудам в дальнейшем, обеспечивая иммунитет к повторному заражению. На этом явлении основана вакцинация: благодаря прививкам, содержащим ослабленные антигены микробов и вирусов, в нашей крови появляется большое количество IgG, которые при контакте с реальной угрозой быстро подавляют инфекцию — до того, как она нанесет вред здоровью.

    Также существуют иммуноглобулины класса А (они в большом количестве содержатся в слизистых оболочках, защищая «подступы» к организму), Е (борются с паразитарными инфекциями) и другие. В лабораторной диагностике объектами интереса чаще всего являются IgM, IgG и IgA: по их концентрации можно оценить, на какой стадии находится инфекционный процесс, а также узнать, болел ли когда-либо человек тем или иным недугом (например, краснухой или ветряной оспой).

    Как узнать, какие именно антигены или антитела присутствуют в организме человека? Когда врач предполагает, что причиной заболевания является определенная инфекция, или желает измерить концентрацию определенного гормона, он назначает пациенту иммуноферментный анализ.

    Реакцию «антиген-антитело» можно воспроизвести в лабораторных условиях: использовать уже готовые антитела или антигены, чтобы определить, есть ли в исследуемом образце соответствующее им соединение.

    Для начала необходимо получить образец биологической жидкости — обычно, это сыворотка крови. Лаборатория использует пластиковые планшеты с лунками, в которых уже содержатся очищенные антигены предполагаемого возбудителя (или — антитела, в случае если задачей является поиск антигена). Образцы вносятся в лунки, где происходит — или не происходит — образование иммунных комплексов. Если «встреча» состоялась, особое красящее вещество вступает в ферментную реакцию с объединенной молекулой, что позволяет с помощью инструментальной оценки оптической плотности сделать выводе о результатах анализа.

    ИФА бывает качественным и количественным. В первом случае подразумевается однозначный ответ: искомое вещество или найдено, или не найдено в образце. В случае с количественным анализом более сложная цепь реакций дает возможность оценить концентрацию антител в крови человека, что в сравнении с результатами предыдущих тестов даст ответ на вопрос о том, как развивается инфекционный процесс.

    Преимущества метода

    Бесспорные преимущества ИФА — высокая чувствительность и специфичность метода. Чувствительность — это возможность распознать искомое вещество, даже если его концентрация в образце невысока. Специфичность же подразумевает безошибочность диагностики: если результат положительный, значит, найдены именно те антитело или антиген, которые предполагались, а не какие-то другие.

    ИФА во многом заменил «золотой стандарт» микробиологии — бактериологический метод диагностики, в ходе которого для идентификации возбудителя требовалось выделить его из организма, а затем в течение нескольких дней выращивать культуру на питательной среде в пробирке. Все то время, пока производился анализ, врачи были вынуждены лечить пациента «вслепую», догадываясь о происхождении микроорганизма по симптомам болезни. Определение IgM с помощью ИФА позволяет поставить точный диагноз уже в первые дни болезни.

    Высокая степень технологичности проведения иммуноферментного анализа минимизирует влияние человеческого фактора, что снижает вероятность ошибки. Большинство используемых в современных лабораториях тест-систем и реактивов для ИФА выпускаются в промышленных условиях, что гарантирует точный результат.

    Недостатки метода

    К сожалению, для проведения ИФА нужно знать, что именно искать: методика анализа подразумевает, что врач заранее имеет предположение о природе заболевания. Поэтому нет смысла назначать такой тест в надежде случайно «угадать» диагноз.

    В случае диагностики инфекционных заболеваний иммуноферментный анализ не может найти возбудителя и определить его специфичные свойства: он лишь указывает на наличие антител в крови у больного, косвенно свидетельствующих о присутствии чужеродного микроорганизма в теле человека.

    ИФА — крайне точный, но не дешевый метод, поэтому обращаться к нему нужно с умом, а интерпретацией результатов должен заниматься квалифицированный врач.

    Показания к назначению и выявляемые заболевания

    Невозможно охватить полный список показаний к проведению ИФА. Вот наиболее распространенные цели анализа:

    1. Диагностика острых и хронических инфекционных заболеваний:
      • IgM и IgG к вирусным гепатитам А, B, C, E, а также антигенов гепатитов В и С;
      • IgG к ВИЧ;
      • Ig M и IgG к цитомегаловирусной инфекции;
      • Ig M и IgG к вирусу Эпштейна-Барр;
      • Ig M и IgG к герпетическим инфекциям;
      • Ig M и IgG к токсоплазмозу;
      • Ig M и IgG к кори, краснухе, сальмонеллезу, дизентерии, клещевому энцефалиту и другим заболеваниям;
      • IgG к паразитарным заболеваниям;
      • Ig M и IgG к инфекциям, передающимся половым путем;
      • IgG к хеликобактерной инфекции.
    2. Общая оценка показателей иммунитета человека и маркёров некоторых аутоиммунных заболеваний.
    3. Выявление онкологических маркёров (фактора некроза опухоли, простатспецифического антигена, раково-эмбрионального антигена и других).
    4. Определение содержания гормонов в сыворотке крови (прогестерона, пролактина, тестостерона, тиреотропного гормона и других).

    Анализируемый биоматериал и особенности его забора

    Основной биоматериал для проведения ИФА — это сыворотка крови: в лаборатории у пациента берут образец крови из вены, из которого в дальнейшем удаляют форменные элементы, затрудняющие проведение анализа. В некоторых других случаях для анализа используется спинномозговая жидкость, околоплодные воды, мазки слизистых оболочек и т.д.

    Для того чтобы избежать искажений в результатах, рекомендуется сдавать кровь натощак, а за две недели до исследования (если целью является диагностика хронических, скрыто протекающих инфекционных заболеваний) необходимо отказаться от приема антибиотиков и противовирусных препаратов.

    Сроки готовности результатов ИФА

    При наличии необходимых реактивов и хорошей организации работы лаборатории результат анализа вы получите в течение 1–2 суток после забора крови. В некоторых случаях, при необходимости получения экстренного ответа, этот срок может быть сокращен до 2–3 часов.

    Расшифровка иммуноферментного анализа

    Результатом качественного ИФА будет однозначный вердикт: искомое вещество либо найдено, либо не найдено в образце. Если же речь о количественном анализе, то концентрация может выражаться числовым значением или определенным количеством знаков «+» (от одного до нескольких).

    Анализируемые показатели

    • IgM — наличие этого класса иммуноглобулинов говорит об остром инфекционном процессе в организме. Отсутствие IgM может говорить как об отсутствии конкретного возбудителя в организме, так и о переходе инфекции в хроническую стадию.
    • IgA при отрицательном результате теста на IgM чаще всего свидетельствует о хронической или скрыто протекающей инфекции.
    • IgM и IgA (совместное присутствие) — два положительных результата говорят о разгаре острой фазы заболевания.
    • IgG говорит либо о хронизации заболевания либо о выздоровлении и выработке иммунитета к инфекционному агенту.

    Возможные результаты ИФА

    В зависимости от содержания анализа в бланке могут быть представлены данные в виде таблицы с перечислением всех антител или антигенов с пометками об отрицательной или положительной реакции, либо будет указано количественное значение результата (отрицательный, слабоположительный, положительный или резко положительный). Последний вариант определяет, сколько антител содержится в анализируемом образце.

    Еще один количественный показатель — индекс авидности антител, выраженный в процентах. Он указывает, сколько времени прошло от начала инфекционного процесса (чем выше индекс — тем больше).

    Сегодня выпускаются тысячи видов тест-систем ИФА, позволяющих обнаруживать специфические антитела и антигены при самых разных патологиях. Поэтому этот анализ используется практически во всех медицинских отраслях. Диагноз, поставленный с помощью ИФА, — это гарантия назначения адекватной терапии и эффективного лечения заболевания.

    www.kp.ru

    Компоненты иммуноферментного анализа – иммунная реакция и ферментативная реакция

     
    Анализ иммуноферментныйИммуноферментный анализ, как видно из названия, состоит из двух разных компонентов – иммунной реакции и ферментативной реакции. Иммунная реакция производит связывание биологических молекул, элементов клетки или микроорганизма, которые собственно и пытаются обнаружить, а ферментная реакция позволяет увидеть и измерить результат иммунологической реакции. То есть иммунная реакция – это часть комплексной методики, которая собственно обнаруживает искомый микроб. А ферментная реакция – это та часть комплексной методики, которая позволяет перевести результат иммунной реакции в форму, видимую глазом, и доступную для измерения рутинными химическими методиками. Исходя из такой структуры метода иммуноферментного анализа, разберем обе его части по отдельности.

    Иммунная реакция, что это? Что такое антитело, антиген?

    Анализ иммуноферментныйЧто такое иммунная реакция? Что такое антиген?
    В первую очередь разберем, что такое иммунные реакции. Иммунные реакции – это специфические реакции связывания антигена с антителом с образованием иммунного комплекса. Что это значит? На поверхности каждой клетки любого организма имеются особые структуры, которые называются антигены. Антигены в целом – это молекулы, которые несут информацию о клетке (подобно информации на бейдже у человека, где указываются основные данные этого человека).

    Индивидуальные и видовые антигены – что это? Зачем нужны эти антигены?

    Имеются антигены индивидуальные, то есть присущие только данному конкретному организму. Эти индивидуальные антигены разные у всех людей, есть похожие друг на друга, но все равно отличающиеся. Двух одинаковых копий индивидуальных антигенов в природе не существует!

    Второй основной тип антигенов – это видовые антигены, то есть присущие какому-либо конкретному виду живых существ. Например, у человека присутствует свой видовой антиген, общий для всех людей, у мышей имеется свой мышиный видовой антиген и т.д. На поверхности каждой клетки обязательно присутствуют видовой и индивидуальный антиген.

    Анализ иммуноферментныйВидовой антиген используют клетки иммунной системы для опознавания «свой – чужой».

    Как происходит узнавание антигена?

    Иммунная клетка связывается с подозрительной клеткой и проводит опознание именно по индивидуальному антигену. В памяти иммунной клетки «записано» как выглядит «свой антиген». Таким образом, если антиген подозрительной клетки совпадает с описанием «свой антиген», значит, эта клетка собственного организма и опасности не представляет. Тогда иммунная клетка «отвязывается» и уходит. А если антиген не совпадает с описанием «свой», тогда иммунная клетка идентифицирует эту клетку как «чужой», а значит потенциально опасный для всего организма. В этом случае иммунная клетка не «отвязывается», а начинает уничтожать опасный объект. Точность такого иммунологического узнавания поражает воображение – 99,97%. Ошибок практически не бывает!
     
     Что такое антитело, иммунный комплекс?
    Анализ иммуноферментныйА что представляет собой антитело?

    Антитело – это особая молекула, расположенная на поверхности иммунной клетки. Именно антитело и связывается с антигенами подозрительной клетки. Далее антитело передает информацию внутрь клетки, где происходит опознавание, и получает обратный сигнал двух видов «свой» или «чужой». При сигнале «свой» антитело разрушает связь с антигеном и отпускает клетку.

    Что такое иммунный комплекс?
    При сигнале «чужой» ситуация разворачивается иначе. Антитело не разрывает связь с антигеном, а наоборот, посылая специфические сигналы, вызывает «подкрепление». Биологически это означает, что другие антитела, находящиеся в другой части клетки, начинают перемещаться к участку, откуда идет сигнал опасности, и также образуют связь между собой и пойманным антигеном. В конце концов, антиген оказывается, окружен со всех сторон и прочно привязан.Такой комплекс антиген + антитело называется иммунный комплекс. С этого момента начинается утилизация антигена. Но сейчас подробности процесса нейтрализации антигена нас не интересуют.

    Виды антител (IgA, IgM, IgG, IgD, IgE)
    Анализ иммуноферментныйАнтитела – это белковые структуры, которые, соответственно, имеют химическое название, которое и используется как синоним слова антитела. Итак, антитела = иммуноглобулины.

    Существуют 5 типов иммуноглобулинов (Ig), которые связываются с разными видами антигенов в разных местах человеческого организма (например, на коже, на слизистых, в крови и т. д.). То есть антитела имеют разделение труда. Эти иммуноглобулины называются буквами латинского алфавита – A, M, G, D, E и обозначаются следующим образом – IgA, IgM, IgG, IgD, IgE.

    В диагностике используют только один вид антител, который наиболее специфичен в отношении определяемого микроба. То есть связывание данного вида антител с определяемым антигеном происходит всегда. Чаще всего применяются IgG и IgM.

    Именно этот принцип иммунной реакции (уникальная точность и специфичность узнавания определяемого биологического объекта) лежит в основе иммуноферментного анализа.В силу высокой точности антител в узнавании антигенов, точность всего метода иммуноферментного анализа оказывается также высочайшей.

    Ферментативная реакция

    Какая реакция – ферментативная? Что такое сродство, субстрат и продукт реакции?
    Анализ иммуноферментныйПерейдем к рассмотрению ферментативной реакции в работе метода иммуноферментного анализа.

    Что такое ферментативная реакция?

    Ферментативная реакция – это химическая реакция, при которой одно вещество под действием фермента превращается в другое. Вещество, на которое действует фермент,называется субстратом. А вещество, которое получается в результате воздействия фермента, называется продуктом реакции. Причем особенность ферментативной реакции такова, что определенный фермент действует только на определенный субстрат. Такое свойство фермента узнавать «свой» субстрат называется сродством.

    Таким образом, каждый фермент проводит только одну, специфичную для него реакцию. Ферментов в биологическом мире известно великое множество, равно как и ферментативных реакций. В иммуноферментной диагностике используется лишь несколько ферментативных реакций – не более 10.При этом выбирали такие ферментативные реакции, продуктом которых являются окрашенные вещества. Почему же продукты ферментативной реакции должны быть окрашенными? Потому что для вычисления концентрации вещества по окрашенному раствору существует простой химический метод – колориметрия.

    Метод колориметрии – суть и принцип

    Анализ иммуноферментныйКолориметрия применяет измерение плотности окраски раствора, а по плотности окраски вычисляют концентрацию вещества.При этом специальный прибор – колориметр измеряет плотность окраски раствора. В колориметрии возможны два варианта зависимости плотности окраски от концентрации вещества – это прямо пропорциональная зависимость или обратно пропорциональная зависимость. При прямо пропорциональной зависимости, чем выше концентрация вещества, тем интенсивнее плотность окраски раствора. При обратно пропорциональной зависимости, чем выше концентрация вещества, тем ниже плотность окраски раствора. Технически это происходит так: берется несколько растворов с известной концентрацией вещества, измеряется плотность этих растворов, строится график зависимости концентрации от плотности окраски (калибровочный график).

    Далее измеряют плотность окраски раствора, концентрацию которого выясняют, и по калибровочному графику находят значение концентрации, соответствующее уровню измеренной плотности окраски раствора.В современных автоматических колориметрах только один раз проводят калибровку, далее аппарат сам строит калибровочную кривую, которая остается в памяти прибора, и измерение происходит автоматически.

    В иммуноферментном анализе чаще всего применяются следующие ферменты: пероксидаза, щелочная фосфатаза, авидин.

    Как же совмещаются иммунологическая и ферментативная реакция в иммуноферментном анализе? Сейчас мы перейдем к рассмотрению собственно иммуноферментного анализа. Какие этапы он включает и что происходит при протекании этих реакций? Иммуноферментный анализ бывает прямой и непрямой.

    Прямой иммуноферментный анализ – этапы проведения

    В прямом иммуноферментном анализе используют антитела к выявляемому антигену, соединенные со специфической меткой. Эта специфическая метка и есть субстрат ферментативной реакции.

    Анализ иммуноферментныйПрикрепление антигенов к поверхности лунки и соединение антигена с антителом

    Как проходит прямой иммуноферментный анализ? Берется биологический материал (кровь, соскобы со слизистых, мазки) и помещается в специальные лунки. Биологический материал оставляют в лунках на 15-30 минут, чтобы антигены могли приклеиться к поверхности лунок. Далее в эти лунки добавляют антитела к выявляемому антигену. Это значит, что выявляя антигены, например, сифилиса, добавляются антитела против антигенов сифилиса. Эти антитела получают промышленным способом, а лаборатории покупают уже готовые наборы.Данную смесь исследуемого материала и антител оставляют на некоторое время (от 30 минут до 4-5 часов), чтобы антитела смогли найти и связаться со «своим» антигеном.Чем больше в биологической пробе антигенов, тем больше антител свяжется с ними.

    Удаление «лишних» антител

    Как было указано, антитела к тому же связаны со специфической меткой.Поскольку антитела добавляются в избытке, то не все они свяжутся с антигенами, а если антигена вообще нет в пробе, то, соответственно, ни одно антитело не свяжется с искомым антигеном. Для того чтобы убрать «лишние» антитела, содержимое из лунок просто выливают. В результате этого все «лишние» антитела убираются, а остаются те, которые связались с антигенами, поскольку антигены «приклеены» к поверхности лунок. Лунки несколько раз ополаскивают специальным раствором, который позволяет вымыть все «лишние» антитела.

    Ферментативная реакция – образование окрашенного соединения

    Анализ иммуноферментныйДалее начинается второй этап – ферментативная реакция. В промытые лунки добавляют раствор с ферментом и оставляют на 30-60 минут. Данный фермент имеет сродство к веществу (специфической метке), с которым связаны антитела. Фермент проводит реакцию, в результате которой эта специфическая метка (субстрат) превращается в окрашенное вещество (продукт). Затем методом колориметрии находят концентрацию этого окрашенного вещества. Поскольку данная специфическая метка связана с антителами, значит, концентрация окрашенного продукта реакции равна концентрации антител. А концентрация антител равна концентрации антигенов. Таким образом, в результате проведенного анализа мы получаем ответ, какова концентрация выявляемого микроба или гормона.

    Именно так проходит прямой иммуноферментный анализ. Однако сегодня чаще используют непрямой иммуноферментный анализ, поскольку чувствительность и точность непрямого выше, чем прямого. Итак, перейдем к непрямому иммуноферментному анализу.

    Непрямой иммуноферментный анализ – этапы проведения

    Анализ иммуноферментныйВ непрямом иммуноферментном анализе два этапа. При проведении первого этапа используют немеченые антитела к выявляемым антигенам, а во втором этапе применяют меченые антитела к первым немеченым антителам. То есть получается не прямое связывание антитела с антигеном, а двойной контроль: связывание антител с антигеном, после чего связывание вторых антител с комплексом антитело + антиген. Как правило, антитела для первого этапа – мышиные, а для второго – козьи.

    Фиксация антигенов на поверхности лунки и связывание антигена с немеченым антителом
    Так же как и для прямого иммуноферментного анализа производится забор биологического материала – кровь, соскобы, мазки. Исследуемый биологический материал вносят в лунки и оставляют на 15-30 минут для приклеивания антигенов к поверхности лунок. Затем в лунки вносят немеченые антитела к антигенам и оставляют на промежуток времени (1-5 часов), чтобы антитела связались со «своими» антигенами и образовали иммунный комплекс (первый этап). После чего удаляют «лишние», не связавшиеся антитела, путем выливания содержимого лунок. Производят промывку специальным раствором для полного удаления всех не связавшихся антител.

    Связывание меченого антитела с комплексом антиген + немеченое антитело
    Анализ иммуноферментныйПосле чего берут вторые антитела – меченые, добавляют в лунки и опять оставляют на некоторое время – 15-30 минут (второй этап). За это время меченые антитела связываются с первыми – не мечеными и образуют комплекс – антитело + антитело + антиген. Однако и меченые, и не меченые антитела вносятся в лунки в избытке. Поэтому нужно опять удалить «лишние», уже меченые антитела, которые не связались с немечеными антителами. Для этого повторяют процедуру выливания содержимого лунок и промывки специальным раствором.

    Ферментативная реакция – образование окрашенного соединения
    После чего вносят фермент, осуществляющий реакцию превращения «метки» в окрашенное вещество. Окраска развивается в течение 5-30 минут. Затем проводят колориметрию и вычисляют концентрацию окрашенного вещества. Поскольку концентрация окрашенного вещества равна концентрации меченых антител, а концентрация меченых равна концентрации немеченых антител, которая, в свою очередь равна концентрации антигена. Таким образом, получаем концентрацию выявляемого антигена.
    Такой двойной контроль в виде использования двух видов антител позволил повысить чувствительность и специфичность метода иммуноферментного анализа. Несмотря на удлинение времени проведения анализа и включение дополнительных этапов, эти потери компенсируются точностью результата. Именно поэтому в настоящее время подавляющее большинство методик иммуноферментного анализа – это непрямой иммуноферментный анализ.

    www.polismed.com


Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *

*